植物線粒體 DNA 提取試劑盒
三，說明
線粒體 DNA提取的關鍵是儘可能的去掉核 DNA。本試劑盒利用差速離心得到比較純淨的線粒體，再利用 DNA酶消化和裂解緩衝系統等多步驟去掉核 DNA， 後得到純淨的線粒體 DNA。可用於 PCR等對純度要求較高的實驗。
本試劑盒用於從植物葉片中分離出完整而純化的線粒體。適合于田間採摘或者實驗室培養的植物葉片中線粒體 DNA的提取製備。
四，操作步驟
準備工作：在 DNASE I中加入 600ul（ 50T）或者 1100ul（ 100T）的 DNA酶反應液，適當分裝後 -20℃儲存。線粒體裂解液保存於常溫，如有沉澱 37℃水浴溶解，離心機溫度下降到 4℃（2-8℃），如無低溫離心機，也可以常溫離心，並將離心時間爲10min的改爲5min，但 後所得DNA品質及產量可能會有一定影響。
1. 樣本採集前處理：無論田間自然生長還是實驗室組織培養，採摘前須避光生長 24-48小時，以減少葉片組織中糖類及葉綠體含量。取適量植物細胞裂解液，加入 0.5% β -巰基乙醇， 10ml 植物細胞裂解液加入 50ulβ -巰基乙醇，混勻，形成植物細胞裂解液 /β -巰基乙醇溶液，此溶液可 2-8度儲存一個月。
2. 葉片用蒸餾水清洗 2-3次，濾紙吸乾，有條件請用液氮研磨葉片 1-2克，研磨完後，取 800mg左右研磨的葉片粉，加入 1.5ml預冷的植物細胞裂解液 /β -巰基乙醇溶液，混勻。如果無條件（無液氮），請預冷研鉢，取洗過的葉片 1000 mg，用剪刀剪爲碎塊放入玻璃勻漿器或者研鉢中。加入 1.5ml預冷的植物細胞裂解液 /β -巰基乙醇溶液，冰上研磨至看不見明顯組織塊；
3. 將研磨物放置合適的離心管， 4℃， 1000× g 離心 5 min；
4. 將上清轉移到一新的離心管中，在沉澱中加入 0.5ml  Lysis Buffer/β -巰基乙醇溶液，混勻，再次 4℃， 1000× g 離心 5 min，取上清；合併兩次上清，將上清 4℃  1000× g 再次離心 5 min。
5．取上清，加入一新的離心管中， 4℃，  16,000 × g 離心 10 min。離心後的上清含胞漿成分，可從中提取胞漿蛋白。將上清轉移到新離心管，線粒體沉澱在管底。
6. 在線粒體沉澱中加入 0.5 mL  Wash Buffer重懸線粒體沉澱， 4℃， 1000× g 離心 5 min；
7．取上清，加入一新的離心管中， 4℃，  16,000 × g 離心 10 min。棄上清，高純度的線粒體沉澱在管底；
8. 加入 100ul  DNA酶反應液重懸線粒體，吹打均勻後，再加入 10ul DNASE I溶液（見準備工作），混勻， 37℃水浴 10min。此步爲消化線粒體表面吸付的核 DNA。 4℃，  12,000 × g 離心 5 min。儘可能的棄上清，再加入 200ul TE 重懸線粒體沉澱， 4℃， 12,000 × g 離心 5 min，洗去殘留的 DNA酶。
9.得到的沉澱，用 200ul TE緩衝液重懸線粒體沉澱，加入 10ul  RNase A。加入 200ul線粒體裂解液，輕輕混勻（不可吹打），放置 1-2min，再加入 150ul蛋白沉澱液，迅速混勻。 4℃，  12,000 × g 離心 5 min。此步驟可進一步去除核 DNA。
10．取上清，加入一新的離心管中（如用於酶切分析，可加入此步：選用等體積的酚 25:24:1抽提一次，再用 抽提一次，或者直接用 抽提兩次，一般來說，此步可去掉一些微量蛋白及糖類，但會造成線粒體 DNA的損失，因而用於 PCR時可省，並不影響後續實驗），加入 0.6倍體積的 （如無 ，可加入 2.5倍體積的乙醇沉澱 DNA，如離心管太滿可分兩管）及 5-10ul覈酸覈酸助沉劑，混勻， -20℃沉澱半小時左右（此步可省）， 4℃，  12,000 × g 離心 10 min。
11. 棄上清，再加入 1ml  70%乙醇清洗， 4℃，  12,000 × g 離心 5min。重複用 70%乙醇洗一次。
12. 棄上清，再次離心 1min 吸棄上清，不要碰到管底，開蓋涼幹約 5-10 5min。
13．加入 20-30ul  TE緩衝液 ,輕彈管底， 37℃水浴 5分鐘，線粒體 DNA溶解。
14. 進行 DNA電泳檢測及 -20℃儲存，進行下步的實驗。