線粒體 DNA 提取試劑盒 一，試劑盒組份

組份	D0215 (50T)	D0215 (100T)
細胞裂解液	50 mL	100 mL
線粒體清洗液	25 mL	50 mL
DNA酶I	12mg	22mg
DNA酶反應液	6ml	12ml
線粒體裂解液	10ml	20ml
蛋白沉澱液	7.5ml	15ml
覈酸助沉劑	0.5ml	1ml
TE緩衝液	15ml	30ml

二，儲存條件本試劑盒整體保存於 2-8度一年。使用前，在 DNA酶 I中加入 600ul（ 50T）或者 1100ul（ 100T）的 DNA酶反應液，分裝後 -20度儲存。線粒體裂解液使用前常溫儲存，如有沉澱可 37度水浴溶解，不影響使用。 三，說明線粒體 DNA提取的關鍵是儘可能的去掉核 DNA。本試劑盒利用差速離心到比較純淨的線粒體，再利用 DNA酶消化裂解緩衝系統等多步驟去掉核 DNA， 後得到純淨的線粒體 DNA。可用於 PCR等對純度要求較高的實驗。本試劑盒用於從動物細胞或組織中分離出完整而純化的線粒體。適合於動物軟組織（肝或腦組織）和硬組織（肌肉）以及培養細胞線粒體 DNA的提取製備。不適合植物及其他標本的提取。 四，操作步驟 準備工作：在 DNA酶 I中加入 600ul（ 50T）或者 1100ul（ 100T）的 DNA酶反應液，適當分裝後 -20度儲存。線粒體裂解液保存於常溫，如有沉澱 37℃水浴溶解，離心機溫度下降到 4℃（2-8℃），如無低溫離心機，也可以常溫離心，並將離心時間爲10min的改爲5min，但 後所得DNA品質及產量可能會有一定影響。 1. 樣本處理 a. 組織勻漿：稱取 100~200 mg新鮮組織如 、腦、心肌等， PBS或生理鹽水沖洗，洗淨血水，濾紙吸乾，用剪刀剪爲碎塊放入小容量玻璃勻漿器內。加入 1.0 mL冰預冷的 Lysis Buffer， 0℃冰浴上下研磨組織 20次； b. 培養細胞勻漿：消化細胞， PBS洗滌， 800 × g 5~10 min離心收集細胞。計數。每次提取需要 5 × 10⁷個細胞，加入 1.0 mL冰預冷的 Lysis Buffer重懸細胞，將細胞懸液轉移到小容量玻璃勻漿器內， 0℃冰浴研磨 30~40次； 2. 將組織或細胞勻漿物轉移到離心管， 4℃， 1000× g 離心 5 min； 3. 取上清，加入一新的離心管中， 4℃， 1000× g 再次離心 5 min。 4．取上清，加入一新的離心管中， 4℃，  12,000 × g 離心 10 min。離心後的上清含胞漿成分，可從中提取胞漿蛋白。將上清轉移到新離心管，線粒體沉澱在管底； 5. 在線粒體沉澱中加入 0.5 mL  Wash Buffer重懸線粒體沉澱， 4℃， 1000× g 離心 5 min； 6．取上清，加入一新的離心管中， 4℃，  12,000 × g 離心 10 min。棄上清，高純度的線粒體沉澱在管底； 7. 加入 100ul  DNA酶反應液重懸線粒體，吹打均勻後，再加入 10ul DNA酶 I溶液（見準備工作），混勻， 37度水浴 10min。此步爲消化線粒體表面吸付的核 DNA。 4℃，  12,000 × g 離心 5 min。儘可能的棄上清，再加入 200ul TE 重懸線粒體沉澱，離心，洗去殘留的 DNA酶。 8.得到的沉澱，用 100ul TE 重懸線粒體沉澱。加入200ul線粒體裂解液，輕輕混勻（不可吹打），放置 2min左右，不超過 5min，再加入 150ul蛋白沉澱液，迅速混勻。 4℃，  12,000 × g 離心 5 min。此步驟可進一步去除核 DNA。 9．取上清，加入一新的離心管中（可選用等體積的酚 25:24:1抽提一次，再用 抽提一次，或者直接用 抽提兩次，一般來說，此步可省，並不影響後續的 PCR），加入 0.6倍體積的 （如無 ，可加入 2.5倍體積的乙醇沉澱 DNA）及 10ul覈酸覈酸助沉劑，混勻， -20℃沉澱半小時左右（此步可省）， 4℃，  12,000 × g 離心 10 min。 10. 棄上清，再加入 1ml  70%乙醇， 4℃，  12,000 × g 離心 10 min。重複用 70%乙醇洗一次。 11. 棄上清後再次離心 1min 吸棄上清，開蓋涼幹約 5-10分鐘。 12．加入 20-30ul  TE緩衝液 ,輕彈管底， 37度水浴 5分鐘，線粒體 DNA溶解。 13. 進行 DNA電泳檢測及 -20度儲存，進行下步的實驗。 四 注意事項： 1. 爲保證獲得完整及儘可能多的線粒體，勻漿條件要示： 是全程低溫操作。 是快速。 ，如用條件可將勻漿後的碎片在顯微鏡下觀察。與組織塊相比，培養細胞特別是貼壁培養細胞在用玻璃勻漿器勻漿時較難破壁，因而要選用小容量玻璃勻漿器、間隙嚴密的研杵上下研磨培養細胞。 2．線粒體 DNA本身含量很低，如果電泳檢測不到，可加大上樣量，用 少量的 TE溶解沉澱，或者直接進入 PCR檢測。 2. 以離心力 g計算正確的離心速度，不同的離心機可據此精確計算離心速度。